Artxiboa: ‘2012ko berriak’

Informe de la evolución del estudio en retinosis pigmentaria de Biodonostia 2012

31/12/2012 

A lo largo del presente año hemos procedido a la caracterización genetico-molecular de los pacientes afectados de Retinosis Pigmentaria (RP) de Gipuzkoa.

 

En coordinación con el Servicio de Oftalmología del Hospital Donostia hemos podido recoger y procesar 277 muestras correspondiente a 110 casos índice y sus familiares.

 

(A) Gracias a la colaboración establecida con el Dr. Carlos Cruchaga en la Universidad de Washington en St. Louis (USA), hemos realizado una búsqueda de variantes genéticas en 5 genes responsables de RP (USH2A, RHO, RPGR, PDE6B, RPE65). Para ello utilizamos la tecnología de secuenciado masivo de última generación conocida como Next Generation Sequencing (NGS).

 

Una de las limitación del uso de las plataformas de secuenciado masivo o NGS es la ingente cantidad de datos que se generan.

 

Esto nos ha llevado a desarrollar

 

(B) técnicas de cribado genético masivo, que hemos aplicado de manera previa al uso de NGS en el resto de genes a analizar en nuestras muestras de pacientes. Dichas técnicas nos ayudarán a minimizar el número de muestras a secuenciar en nuestra plataforma de NGS, y por tanto el impacto generado por la cantidad de datos. Dichas técnicas de cribado genético se basan en:

 

B1.      Diferencias en la temperatura de separación de la doble cadena de DNA ó análisis de High Resolution Melting (HRM), que se está utilizando en los siguientes contextos genéticos:

 

B1.1- Selección de pacientes que cumplen ciertos criterios diagnósticos clínicos (síndrome de Bardet Biedl o síndrome de Usher)

 

B1.2- Genes de pequeño tamaño (< 5kb) con una prevalencia media/alta.

 

B1.3- Locus ricos en mutaciones en genes muy prevalentes de gran tamaño.

 

B2 Arrays de DNA (Axiom® Exome Array de Affymetrix)

 

Consiste en un chip que contiene unas 300.000 secuencias con SNPs causantes de numerosas enfermedades genéticas. De ellas, aproximadamente 5000 están asociadas a patologías de la retina, y unas 1600 son causantes de RP.

 

Planes para el 2013

 

Los planes para el 2013 se podrían resumir en 2 grandes grupos de estrategias:

 

a) actualmente estamos realizando el procesado de muestras para analizar una segunda tanda de genes mediante la plataforma de secuenciado masivo del Instituto Biodonostia (Ion Torrent). El procesado de muestras estará listo para finales del 2012/principios del 2013 y los datos se analizarán a lo largo del 2013.

 

b) por otro lado se está realizando una recolección de muestras de varios familiares de afectados de RP. Una vez finalizada la recolección se procederá a la búsqueda de mutaciones mediante un array de DNA de Affimetrix a lo largo del 2013, de manera similar a como se realizó a lo largo del 2012 con una primera tanda de pacientes y sus familiares.

 

Resumen  2012

 

A) Next Generation Sequencing (NGS)

Se analizaron 5 genes. Se encontraron 14 mutaciones en los 5 genes, en un total de 21 pacientes. En 9 de estos pacientes, la mutación podría explicar la causa de la enfermedad.

 

B) High Resolution Melting (HRM)

Se analizaron un total de 7 genes hasta el momento utilizando esta técnica. Se han encontrado un total de 10 mutaciones en 6 de los genes en un total de 11 pacientes. En 3 de estos pacientes, la mutación podría explicar la causa de la enfermedad.

 

C) Arrays de DNA

En este caso el chip contiene todos los genes implicados en RP y en otras patologías. Se encontraron mutaciones en 4 genes de RP en 8 pacientes. En estos 8 pacientes, la mutación podría explicar la causa de la enfermedad.

 

En conclusión, utilizando las técnicas arriba descritas, hemos encontrado hasta el momento un total de 29 mutaciones en 15 genes de Retinosis Pigmentaria que podría explicar la causa de la enfermedad en 21 pacientes.

“Gipuzkoan Erretinosi Pigmentarioaren Azterlan Epidemiologiko, Kliniko eta Molekularra”-ri buruzko informazio-bilera

2012.02.25

Pasaden otsailaren 25ean Ander Anasagastik, Farmazian lizentziatua eta proiektuaren ikerlari nagusia den Javier Ruiz-en zuzendaritzapean aurre-doktoradutza burutzen ari dena, ikerlanak 2011 urtean zehar izan dituen emaitzak, 2012an jarraitu beharreko estrategiak eta, azkenik, finantziazio-iturri eta inplikaturiko lan-taldeak aurkeztu zituen.
RP-aren inguruko azterlan hau burutzerakoan aurkeztu dituzten erronka edota zailtasun nagusiak azaltzen hasi zuen bere hitzaldia, eta hurrengoak nabarmendu zituen:
– Heterogeneitate genetiko zabal baten existentzia, hau da, inplikaturiko gen asko dago eta oso ezberdinak dira. Mundu mailan RP kasuen %60a suposatzen duten 65 gen ezagutzen dira. Hori dela eta, oraindik kasuen %40a ezezagunak diren gen edo kausetatik eratorritakoa da.
– Oinordetza mendeliar klasikoko hiru tipoez gain oinordetza konplexuak suertatzen dira: digenismoa, oinordetza mitokondriala, heterozigosi osoa edo osoa ez den penetrantzia.
– Eraldaketa bat ez zaio zuzenean patologia bati atxikitzen, hots, gaixotasuna eragiten duena dela bermatu ahal izateko beharrezkoa da asoziazio eta bateragarritasun azterlanak burutzea.
– Orain arte sekuentziazio masiborako erabilitako metodoak, alde batetik, tamaina txiki eta handiko delekzioak aurkitzeko mugapena du eta, bestetik, maneiatu eta interpretatzeko zailak suertatzen diren datu kopuru handia sortzen du eta, era berean, lan astun bezain motela erakarriaz.
Orotara mundu mailan RP kasuen %30a baino gehiago suposatzen duten 5 gen sekuentziatu dira (RHO, USH2A, RPGR, RPE65 eta PDE6B).
2011 URTEAN ZEHAR IZANDAKO EMAITZAK
RP-a eragiten duten eraldaketa patogenikoak dituzten 8 pertsona aurkitu dira, horietako:
– 6 kasu baieztatuta daude.
– 2 kasu ondorengo azterlanekin baieztatzeke daude (zuhaitz genealogikoetako informazioa areagotuz eta zuzeneko gurasoen DNA eskuratuz)
Heterozigosian mutazio errezesiboak dituzten 11 indibiduo aurkitu dira, hau da, ADN-aren kopia bakarrean dute eraldaketa eta, beraz, RP-a eragiten dutenik ezin daiteke baieztatu oinordetza errezesibo batek bi kopiak izan behar baititu mutatuak.
X-ri loturiko genearen eramailea den emakume bat topatu da. Eraldaketa honek ez du emakumezko honetan ematen den gaixotasunaren patogenizitatea argitzen, baina etorkizuneko ikerlanetara iritsi ahal izateko interesagarria da.
2012-RAKO ESTRATEGIAK
Orain arte eskuratutako emaitzak zabaldu ahal izateko helburuarekin hemendik gutxira erabiltzen hasi nahi dituzten metodo berriak zeintzuk diren azaldu zigun Anderrek:
– Era guztietako eraldaketak antzematen dituzten DNA chip-ak, baita tamaina ertainetik txikirako delekzioak ere. Egun ezagutzen diren 65 geneetara hedatzen diren eta RP-ari loturiko 1600 mutazio aurkezten dituzten chip-ak existitzen dira. Ekonomikoki euren balioa nabarmenki jaitsi da.
– HRM metodoa: mota orotako mutazioak detektatzen dira, baita delekzio txiki eta ertainak ere. Ez digu esaten ez zein motatako eraldaketak diren ezta non dauden ere, baina gaixo guztien baheketa bat egiten laguntzen digu mutazioa dagoen edo ez esaten baitu.
– MLPA metodoa: delekzio eta intserzio ertain eta handiak antzematen ditu.
– Entzima Murriztaileen erabilera: zehazturiko sekuentziak detektatzen ditu.
FINANTZAKETA
Ikerlan hau aurrera eraman ahal izateko dagoen finantzaketa Miguel Servet Kontratuari Loturiko Proiektu (2011-2013), Saiotek Proiektu (2011-2012) eta BEGISARE elkartea gauzatzen ari den dohaintzetatik (2009, 2010, 2011) eratortzen da.
INPLIKATURIKO LAN-TALDEAK
Proiektuan orain arte eta epe ertain-luze batean parte hartzea aurreikusten diren lan-taldeak hurrengoak dira: Donostia Ospitaleko Oftalmologia Zerbitzua (Cristina Iriogyen eta Javier Mendicute), Biodoostia Institutua (Javier Ruiz Ederra, Adolfo López de Munain, Olatz Barandika eta Ander Anasagasti), Washington-eko Unibertsitatea Saint Louis-en (Carlos Cruchaga), Inbiomed (Cristina Sánchez eta Charo Sánchez) eta Quirón Klinika (Giacomo de Benedetti).
Bukatzeko, atsegin handiz erantzun zien sortu ziren galdera guztiei.

 

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